일리윤 세라마이드 아토로션은 저희 아이와 남편이 피부를 많이 긁을 때 도움을 많이 받은 제품입니다. 이번글에서는 아토피 피부를 위한 실험 중 세포실험 및 동물실험을 확인하는 방법에 대하여 알아보고자 합니다. 아토피 피부는 아직도 그 원인과 해결방법을 명확하게 찾아내지 못한 피부 질환입니다.
하지만 100% 확실한 방법은 증상이 심할 경우 도움이 될 수 있다고 알려진 다양한 방법들이 있는데 아토피개선효과평가시험방법은 증상에 도움이 될 수 있는지 소재를 스크리닝하고 작용기전을 확인할 수 있으며 대표적으로 세포실험(In vitro test)와 동물실험(In vivo test)가 있고 이후 임상시험을 진행할 수 있습니다.
일리윤 세라마이드 아토로션 (아토피 실험)
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세포실험 등
아토피피부염은 유전적, 환경적인 원인에 의해 심한 가려움과 함께 염증에 의한 습진 등의 증상으로 점차 악화되는 경향이 있고 이후 완화와 재발 등의 악순환이 반복되면서 고통을 주는 피부질환입니다.
특히나 참을 수 없는 심한 수준의 가려움은 수면을 어렵게 할 뿐만 아니라 정신적으로 큰 스트레스를 유발 할 수 있습니다. 이처럼 큰 고통을 수반하는 질환이기 때문에 기본적으로 피부과를 가셔서 전문가에게 진단을 받으시고 효과적인 치료를 받는 것은 기본이고 이 외에 집에서는 피부 보습을 비롯한 효과적이다라고 알려진 성분들을 함유한 보습제(화장품)도 꾸준하게 사용하는 것이 도움이 될 수 있습니다.
대식세포이용
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대식세포는 알러지성 염증반응을 매개하는 중요한 면역세포로 외부 항원 자극이 있을 경우 염증 반응을 유도하는 IL-6, IL-1베타, TNF-알파 등과 같은 염증 매개성 사이토카인을 분비하면서 이후의 염증반을을 매개하게 됩니다.
배양된 Raw264.7 대식세포에 시료를 전처리한 후에 lipopolysaccharide로 세포 활성을 유도한 후 ELISA를 이용해서 TNF-알파의 양을 측정하여 시료가 염증성 사이토카인인 TNF-알파의 생성을 얼마나 억제하였는지를 확인합니다. 또한 RT-PCR을 이용하여 IL-6, IL-1베타, TNF-알파 등의 mRNA 발현에 미치는 영향을 평가합니다.
세포독성
아토피피부의 개선 가능성이 있다고 고려되는 소재가 있을 경우 이가 피부 내 세포들에 대하여 세포독성이 얼마나 있는지를 확인하는 실험으로 적은 농도에서도 세포독성이 크게 되면 아토피피부의 개선 소재로 활용이 당연히 불가능하게 됩니다. 이 때 실험 대상세포로는 섬유아세포나 대식세포를 이용하게 됩니다.
섬유아세포 Chinese Hamster Lung Fibroblast V79-4를 Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM) 10%를 Fatal Bovine Serum(FBS)에 배양한 다음 96-well culture plate에 2×10의 5제곱/well의 농도로 씨딩하여 24시간 배양한 후 이 시료를 Dimethyl sulfoxide(DMSO)에 5%로 녹여서 고농도 스톡솔루션을 만든 다음 DMEM 3% FBS 배지에 DMSO 농도가 1% 이하가 되면서 시료의 농도를 다양하게 희석하여 well당 200마이크로리터씩 넣고 다시 24시간 더 추가로 배양합니다.
세포의 생존율 평가를 위해서 MTT 시약을 1mg/ml 로 처리한 이후에 4시간 더 배양하고 배양액을 제거한 후 DMSO 처리하여 insoluble 상태의 MTT를 용출시킵니다. 이를 405nm에서 흡광도를 측정하여 세포독성을 평가하게 됩니다. blank solution에 비해서 상대적으로 흡광도 비율을 확인하여 최종 세포생존율(viability)를 산출하게 됩니다.
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비만세포 이용
비만세포는 Mast cell이라고 하고 세포내 과립안에 히스타민, 프로테아제, 류코트리엔 및 각종 사이토카이을 포함하고 있는 세포로 특히 외부항원에 의해서 lgE가 활성화되면 이에 반응하여 급격하게 mediators를 세포 외부로 분비하게 됩니다. 그결과 혈관확장이나 혈관침투성 증가 및 다양한 염증관련 세포의 조직내 침윤을 유도면서 알러지 유발에 결정적인 역할을 담당하는 것으로 알려져 있습니다.
최종적으로 외부 항원에 의한 비만세포의 활성을 효과적으로 억제할 경우 알러지 유발을 억제할 수 있을것으로 판단할 수 있습니다.
먼저 Human Mastocytoma Cell이라고 하는 HMC-1 cell을 이용하는 방법이 있는데 이 HMC-1 비만세포는 백혈병 환자의 말초혈관으로부터 분리된 비만세포로 미성숙한 비만세포의 특징을 보입니다. 이 세포는 매우 낮은 수준의 히스타민을 가지고 있으며 표면형 IgE수용체를 발현하지 않기 때문에 HMC-1 비만세포는 항원 유도성 IgE 수용체 결합에 의한 활성화는 나타나지 않는 것으로 알려져 있으나 phorbol ester와 calcium ionophore에 의해 IgE 의존적 활성과 유사한 세포활성화가 일어나기 때문에 비만세포 연구에 널리 이용되는 세포입니다.
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HMC-1 비만세포는 Iscove’s modified Dulvecco’s media로 배양하며 비만세포 활성화 물질로는 25마이크로M A23187과 5마이크로 M PMA를 이용합니다. 배양된 비만세포에 각각 다른 농도의 시료로 처리한 후 30분간 배양하고 ㅁ23187 및 PMA를 첨가하여 비만세포 활성을 유도합니다. ELISA를 이용하여 비만세포 내에서 합성된 염증매개 사이토카인인 IL-4, IL-5, TNF-알파를 측정하면서 시료에 의한 비만세포 활성 억제 효과를 평가합니다.
ㅇ아토피 피부염 증상,원인 (아토피크림, 아토피에 좋은 성분 : 세라마이드/지방산/콜레스테롤/)
두번째로는 Rat Peritonal Mast Cell(RPMC)을 이용하는 방법이 있습니다. 수컷 Sprague-Dawley rat의 복강에서 비만세포를 분리하고 정제하여 얻는RPMC의 수가 2×10의 5제곱이 되도록 하여 알파-F media와 혼합하여 1ml을 튜브에 넣고 20분 정도 세포 안정화를 하기 위하여 preincubaion시킵니다.
시험 시료처리는 농도별로 하는데 최종 농도는 100X stock을 만들어서 1/100농도로 처리한 후에 30분 정도 안정화를 위해 incubaion합니다. 비만세포로부터 분비된 히스타민의 정량은 형광염섹제와 spectro fluorometer를 이용하여 측정합니다. 히스타민 유리억제율로서 비만세포 활성억제 효과를 평가하게 됩니다.
동물실험
세포실험을 통해 스크리닝되어 효과가 확인 시료들은 다시 동물을 대상으로 안전성 미 효과확인실험을 진행하게 됩니다. 시료의 종류 또는 농도에 따른 정성적, 정량적인 평가를 시행하게 됩니다.
Allergenicity 평가
아토피개선 가능성이 있다고 고려되는 시료가 오히려 알러지를 유발하는지는 확인하는 실험으로 알러지유발가능성 평가라고도 부릅니다. 적은 농도에서도 알러지 유발가능성이 크다면 아토피 개선 소재로 활용이 어렵습니다. 알러지성 접촉성 피부염을 시험하는 방법은 기니피그를 이용한 피부감작성 시험방법이 일반적이지만 최근에 이를 대체하는 방법이 일반적이지만 최근에 이를 대체하는 방법인 Local Lymph Node Assay(LLNA)가 있습니다.
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LLNA 방법은 암컷 Balb/c mouse에 시료를 농도별로 피부에 1일 1회 3일동안 연속 도포하여 감작시키면서 진행하는데 동물실험을 반대하고 있는 사회적인 분위기가 만연한 상황에서 인간의 불편함을 개선하고 안전한지, 효과가 있는지를 확인하기 위해 동물들을 희생시키는 방법은 이제는 다른 방법으로 대체했으면 좋겠다는 생각이 듭니다.
국소알러지 반응평가
비만세포 의존적 알러지성 염증에 대한 효과를 검증하기 위한 방법으로 rat이나 mouse를 대표적인 알러지 유발물질로 알러지를 유발시킨 후 아토피피부염모델로 유도한 후 시료의 항알러지효과를 평가하게 됩니다.
임상실험
세포실험 및 동물실험을 통해 안전성과 효능이 확인된 시료들을 대상으로 시료자체 또는 시료를 함유한 제제를 피시험자를 대상으로 임상시험을 진행하게 됩니다. 피시험자를 대상으로 한 임상시험을 인체에 대한 안정성과 효능을 확인하기 위해 진행하는 것입니다.
피부 자극성 평가
건강한 피시험자를 대상으로 피부첩보시험(패치테스트)를 진행합니다. 시료가 침적된 첩보를 부착하고 48시간이 경과된 이후 첩포를 제거합니다. 30분 후에 첫 육안판독을 하고 96시간이 경과한 후에 2차 육안판독을 시행하는데 자극의 반응 정도에 따라 가중치를 부여학 피시험자 모두의 결과를 종합한 피부평균반응도로서 자극성을 판정합니다.
보습효과 평가
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피시험자의 상박부를 대상으로 하여 시료의 도포전과 도포후의 피부 보습상태를 corneometer나 Evaporimeter로 측정합니다. Corneometer는 피부 전도도를 측정함으로서 피부의 수분함량을 측정할 수 있으며 Evaporimeter는 피부를 통한 수분증발율을 측정할 수 있습니다. 보습효과는 피부의 수분함량이 높아지는 정도와 TEWL이 감소하는 정도로 평가할 수 있습니다.
아토피피부염을 개선, 치료, 재발방지하기 위해서는 피부의 보습과 장벽기능 유지가 중요합니다. 현재까지 많은 성분들이 검토되고 있으나 아직 완벽한 성분은 발견하지 못했고 증상의 불편함에 도움을 줄 수 있는 정도입니다.
그렇기 때문에 치료보다는 증상을 불편함을 줄여줄 수 있는 성분이나 생활습관을 개선하여 습관화하는 것이 중요하겠습니다.
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